تحقیق درباره بررسی همسان سازی ژن

اختصاصی از فی گوو تحقیق درباره بررسی همسان سازی ژن دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .

فرمت فایل word: (لینک دانلود پایین صفحه) تعداد صفحات : 42 صفحه

فهرست مطالب

همسانه سازی ژن.. 1

1-1- تاریخچه همسانه‌سازی ژن.. 1

1-2- ابزارهای کار مهندسی ژنتیک... 2

1-3- آنزیم‌های مورد استفاده 3

1-4- تکنیک‌های مورد استفاده در همسانه‌سازی.. 9

1-5- ناقلین همسانه‌سازی.. 9

1-6- میزبان‌ها 14

1-7- تراریختی Transformation.. 16

1-8- غربالگری α-complementation.. 16

1-9- استخراج پلاسمید و تعیین تعداد نسخه های آن.. 21

پروتکل آزمایشگاهی.. 23

2-1- تهیه محیط کشت باکتری.. 23

2-2- کشت خطی و کشت مایع باکتری DH5α.. 24

2-3- تهیه سلول‌های مستعد. 25

2-4- واکنش پیوند (لیگاسیون) 26

2-5- انتقال پلاسمیدها به باکتری (ترانسفورماسیون) 27

2-6- غربالگری پرگنه‌‌ها 30

2-7- استخراج پلاسمید نوترکیب... 30

2-7-1- استخراج پلاسمید از روش دستی.. 30

2-7-2- استخراج پلاسمید با استفاده از کیت Roche. 33

2-8- تعیین کیفیت و کمیت پلاسمید نوترکیب استخراج شده 33

پیوست 1.. 35

فهرست شکل ها

شکل 1-1- شمای کلی انجام همسانه‌سازی.. 1

شکل 1-2- شمای لیگاسیون در TA Cloning. 6

شکل 1-3- تولید کنکاتمر از محصولات PCR دارای انتهای صاف.. 8

شکل 1-4- الف)باکتریوفاژ لامبدا ب) باکتریوفاژ M13.. 10

شکل 1-5- نقشه پلاسمید pTZ57R/T و مکان‌های برشی آن. 13

شکل 1-6- اپران لاکتوز 17

شکل 1-7- ساختار تترامر آنزیم بتاگالاکتوزیداز 18

شکل 1-8- تنظیم اپران لاکتوز 19

شکل 1-9- استراتژی α-complementation مورد استفاده در همسانه سازی ژن ها 20

فهرست جداول

جدول 1-1- جدول بازده برش بعضی از اندونوکلئاز های متداول. 5

جدول 1-2: ساختار انتهای ′3 محصولات تولیده بوسیله Taq پلیمراز 6

جدول 1-3: عناصر ژنتیکی ناقل pTZ57R/T. 14

جدول 1-4: خصوصیات ژنتیکی باکتری DH5α.. 15

1-1- تاریخچه همسانه‌سازی ژن

سالهای 1971 تا 1973 را به عنوان یک دگرگونی در بیولوژی مدرن نام می‌برند. در این سال‌ها یک متدولوژی کاملاً جدید توسعه یافت و امکان داد تا آزمایشهایی که قبلاً عملی نبودند، با موفقیت طرح‌ریزی و انجام شوند. این روشها تحت عنوان تکنولوژی نوترکیبی DNA یا مهندسی ژنتیک نامیده شده‌اند و فرآیند همسانه‌سازی ژن‌ها را در بر می‌گیرند. هدف از همسانه‌سازی ژن فراهم کردن نسخه‌های متعدد از یک ژن منفرد است. تکثیر یک ژن در حوزه‌های مختلف تحقیقاتی مورد استفاده است.

1-2- ابزارهای کار مهندسی ژنتیک

ابزارهای کار مهندسی ژنتیک در آزمایشگاه عبارتند از :

1- باکتری بعنوان میزبان.

2- پلاسمید (یا بقیه ناقلین) به عنوان حامل ژن.

3- آنزیم بعنوان وسیله برش و اتصال قطعات DNA به یکدیگر.

مراحل اصلی در همسانه‌سازی ژن عبارتند از:

• تولید یا جداسازی قطعه‌ای از DNA حاوی ژنی که باید همسانه شود. این قطعه را می‌توان از تکنیک PCR در ساخت ژن و یا با استفاده از آنزیم‌های محدودگر تولید نمود. این قطعه را وارد یک ملکول حلقوی DNA که ناقل نامیده می‌شود می‌کنند. تا کنون ناقل‌های بسیاری چه به صورت طبیعی کشف و یا به صورت صنعتی متناسب با روش‌های متفاوت تولید شده‌اند. از معمول‌ترین ناقل‌ها می‌توان به پلاسمیدها، فاژ، کاسمیدها و فاژمید‌ها اشاره کرد. ورود قطعه مورد نظر به داخل پلاسمید تولید یک مولکول نوترکیب DNA می‌کند.
• ناقل ژن را به سلول میزبان حمل می­نماید که معمولاً یک باکتری است. باکتری‌هایی که به عنوان میزبان در کارهای مهندسی ژنتیک قابل استفاده می‌باشند دارای خصوصیات ویژه‌ای هستند.
• باکتری‌هایی که ناقل را دریافت می‌کنند توانایی رشد در محیط­های کشت انتخابی را پیدا می‌کنند و شروع به تکثیر می‌کنند. در درون باکتری، ناقل نیز تکثیر می‌یابد و در واقع از ژنی که حمل می‌کند نسخه‌های مشابه و متعددی تولید می­نماید. این ناقلین در هنگام تقسیم میزبان به نتاج منتقل شده و همانندسازی ناقل تا رسیدن به باکتری به فاز مرگ ادامه پیدا می‌کند.
• پس از تقسیم زیاد سلول میزبان، هر سلول بسته به طبیعت ناقل دارای یک یا تعداد بیشتری از ناقل نوترکیب خواهد بود.

1-3- آنزیم‌های مورد استفاده

دستورزی DNA نیاز به بکارگیری تعدادی از آنزیم‌ها دارد. این آنزیم‌ها به صورت طبیعی در داخل سلول وظایف متعددی از جمله همانندسازی، نسخه برداری، ترجمه و دیگر پروسه‌های بیولوژیکی را بر عهده دارند. واکنش‌هایی که بوسیله ‌این آنزیم‌ها کاتالیز می‌شوند یک بخش ضروری از همسانه‌سازی ژن را تشکیل می‌دهند (احمدیان تهرانی، 1377). برخی از مهمترین این آنزیم‌ها عبارتند از:

الف) آنزیم‌های محدودگر: این آنزیم‌ها اندونوکلئاز‌هایی هستند که پیوندهای فسفودی استر داخل اسیدهای نوکلئیک را در یک توالی خاص برش می‌دهند. این توالی به عنوان سایت برشی آنزیم نام برده می‌شود. همچنین این آنزیم‌ها براساس نوع برشی که ‌ایجاد می‌کنند به دو دسته آنزیم‌های تولیدکننده پایانه‌های صاف و پایانه‌های چسبنده تقسیم بندی می‌شوند. عموماً برای کارهای مرتبط با همسانه سازی سعی بر استفاده از آنزیم هایی است که تولید محصولات با انتهای چسبنده می کنند. زیرا در زمان لایگشن به انرژی کمتری نسبت به انتهای صاف برای اتصال نیاز دارند. توالی های برشی این آنزیم ها به صورت پالیندروم است (به عنوان مثال GGGCCC). جهت شناسایی مکان های برشی بر روی یک قطعه DNA می توان از نرم افزار هایی همچون Primer Premier 5.0 استفاده نمود. همچنین سایت های اینترنتی نیز به این منظور طراحی گردیده اند که آدرس آنها در پیوست 1 آورده شده است. جهت استفاده از این آنزیم ها نیاز است که حتماً جایگاه برشی آنها در ناحیه مطلوب و مورد نظر ما قرار داشته باشد. معمولاً این جایگاه ها را می توان با استفاده از PCR به انتهای محصولات اضافه نمود.

• نکته: قبل از ورود به یک پروسه همسانه سازی ژن نیاز است که حتماً وکتور مورد استفاده و میزبان مناسب انتخاب شده باشند.
• نکته: قبل از اضافه کردن جایگاه های برشی آنزیم های محدودالأثر به انتهای پرایمر ها از نوع آنزیم و جایگاه برشی آن در وکتور و خود قطعه DNA اطلاع یابید.
• نکته: جهت اضافه کردن جایگاه های برشی آنزیم ها به انتهای '5 پرایمر های PCR (به صورت Linker) توجه کنید که حتماً چند نوکلئونید (بین 3 تا 10) پس از جایگاه برشی آنزیم قرار گرفته باشد تا از برش موثر محل شناسایی پس از ورود پرایمر به داخل محصول PCR اطمینان حاصل شود (جدول 1-1).