اختصاصی از
فی گوو دانلود مقاله نمایش زیاد و نقش های تنظیمی انتخابی محور دانلود با لینک مستقیم و پر سرعت .
نمایش زیاد و نقش های تنظیمی انتخابی محور IL-23/IL-17 در آسیب های پلانوس لیکن دهانی(OLP)
روئی لو، زین ژنگ، کی هان، مو لین، لانگ لانگ، هانگزیا دان
محور IL-23/IL-17 (اینترلوکین) یک مسیر سیگنال دهی التهابی کشف جدید است و در بیماری زایی بسیاری از اختلالات التهابی و ایمنی مزمن شامل می باشد. در اینجتا ما بررسی کرده ایم که آیا محور IL-23/IL-17 در آسیب های پلانوس لیکن (OLP) وجود دارد که یک بیماری التهابی مزمن است که بر روی مخاط دهانی تأثیر می گذارد. ما با استفاده از شیمی بافتی و سلولی ایمنی و PCR کمی پی بردیم که واحدهای فرعی IL-23 و IL-17 در آسیب های OLP در مقایسه با بافت های مخاط دهانی طبیعی، بیش از حد نمایش داده شده است. همچنین، نمایش IL-23 و IL-17 رابطه مثبتی با بافت های OLP شبکه ای دارند. نتایج بدست آمده از مطالعات آزمایشگاهی مشخص ساخت که IL-23 برون زاد میتواند درصد سلول های Th17 و تولید IL-17 در سلول های CD4+T را در بیماران OLP شبکه ای افزایش دهد. ما همچنین پی بردیم که IL-17 برون زاد میتواند تا حد زیادی نمایش mRNA از دفنسین-بتا-2، -3، CCL-20، IL-8، و TNF-آلفا را افزایش دهد اما دفنسین-بتا-1 ، CXCL-9، -10، -11 ، CCL-5 و IL-6 را در سلولهای اپیدرمی دهانی انسان را افزایش نمی دهد. بطور کلی، نتایج ما یک الگوهای نمایش زیاد و نقش های تنظیمی انتخابی محور IL-23/IL-17 در آسیب های OLP را مشخص ساخت، که نشان میدهد که این میتواند یک مسیر تنظیمی مهم در شبکه ایمنی پیچیده آسیب های OLP است.
1- مقدمه
پلانوس لیکن دهانی (OLP) یک بیماری التهابی مزمن است که بر روی مخاط دهانی تأثیر می گذارد و حدود 1 تا 2 درصد مردم به آن مبتلا هستند. این بیماری وقتی ایجاد شود، آسیب ها بندرت خود بهبود می یابند، و در بعضی از موارد بدخیم هستند. از لحاظ بافت شناسی، OLP توسط التهاب مخاطی متراکم لنفوسیت ها، افزایش تعداد لنفوسیت ها، و انحطاط سلولهای اپیدرمی توصیف می گردد. التهاب لنفوسیت عمدتاً از سلول های Tتشکیل می گردد.
اگرچه سبب شناسی OLP نامشخص مانده است، با اینحال مدارک از نقش اختلال ایمنی برای بیماری زایی OLP و خصوصاً همراه با واکنش ایمنی با وساطت سلول های T و تکثیر غیر عادی ملکول های التهابی مختلف پشتیبانی میکنند. مطالعات قبلی تشخیص داده اند که ملکول های التهابی مختلفی بصورت نامنظم ترکیب می گردند و توسط سلول های ملتهب T و سلولهای اپیدرمی تغییر یافته در آسیب های OLPتراوش می گردند ، که به آغاز و تداوم واکنش های التهابی کمک میکند. این یافته ها نشان میدهند که توسعه آسیب OLP رابطه نزدیکی با فعالسازی، تولید و عملکردهای این ملکول های التهابی دارد.
محور IL-23/IL-17 یک مسیر التهابی کشف شده است که در آن، IL-23 و IL-17 دو سیتوکین اساسی هستند. IL-23 یک سیتوکین هترودیمریک التهابی است که از یک واحد فرعی p19 و واحد فرعی معمول p40 با IL-12 مشترک تشکیل شده است. IL-23 با تراوش توسط انواع سلول های مختلف، بعنوان یک عامل محرک مهم در واکنش ایمنی عمل میکند. IL-23 بعنوان یک نقش ضروری در القاء و نگهداری یک واحد فرعی جدید از سلول های CD4+Th عمل میکند که Th17 نام دارد. IL-23 همچنین Th17 را تحریک میکند تا سیتوکین متمایز IL-17 خود را تولید کند، که از دو واحد فرعی AIL-17 تشکیل شده است. در نتیجه، IL-17 بعنوان یک سیتوکین التهابی عمل میکند، که میتواند سلول های مختلف مانند روپوشه ای، درون پوشه ای، تار رویان، کوندروسیت، و استخوان زا را برای تولید ملکول های التهابی مختلف مانند سیتوکین ها، چموکین ها، دفنسین ها و MMP ها فعال کند. محور IL-23/IL-17 همراه با این تولیدات التهابی پایینی حضور وسیعی در فرآیند های التهاب مزمن در وضعیت های آسیب شناختی مختلف دارد. محور IL-23/IL-17 بتازگی اینطور توصیف شده است که نقش اصلی را در بیماری زایی بیماری های ایمنی و التهابی مختلف مانند التهاب روماتیسمی (RA) ، پسوریازیس، التهاب پوست، بیماری روده التهابی (IBD) و التهاب لثه بازی میکند.
در مطالعات قبلی ما سطوح سرم و بزاق IL-17 را در بیماران OLP شناسایی کرده ایم اما هیچ تفاوت مهمی در مقایسه با گروه های سالم پیدا نکردیم. در بررسی های دیگر، وجود IL-17 در آسیب های OLP یافت شده است که نقش آنرا در محیط های موضعی نشان میدهد. البته تاکنون نققش محور IL-23/IL-17 در بیماری زایی OLP نامشخص مانده است. هدف مطالعه حاضر اینست که الگوهای نمایش و نقش های تنظیمی محور IL-23/IL-17 را در OLP بررسی کند.
2- مواد و روشها
2.1 بیماران، کنترل ها، و نمونه ها. همه نمونه های بافت و خون بیماران OLP و داوطلبان سالم از مدرسه غربی چین و بیمارستان دهان پزشکی دانشگاه سیچوان بدست آمدند. موارد OLP از لحاظ بالینی تشخیص داده شدند، از لحاظ آسیب شناسی تأیید شدند، و بعنوان شکل های شبکه ای یا فرساینده بر مبنای معیارهای شناختی WHO (سازمان بهداشت جهانی) برای OLP تقسیم بندی شدند. دو گروه فرعی OLP برای سن و جنسیت مطابقت داده شدند. همچنین، سن و جنسیت مطابقت داده شده با افراد سالم بعنوان توابع کنترل بکار گرفته شدند. توابع با بیماری های سیستماتیک یا دهانی دیگر و یا داروهای پشتیبان ایمنی یا کورتیکو استروئید ها در 3 ماه قبل از جمع آوری نمونه ها از نام نویسی حذف شدند.
برای شیمی بافتی و سلولی ایمنی (IHC)، 27 نمونه آسیب OLP شامل 13 شکل فرساینده و 14 شکل شبکه ای، از آرشیوهای بخش آسیب شناسی بدست آمدند و 10 بافت مخاط دهانی طبیعی (NOM) از افراد داوطلب جمع آوری شد. برای تحلیل های PCR کمی، 14 OLP شبکه ای و 10 بافت NOM بترتیب در حین بافت برداری یا جراحی اورتوگناتیک بدست آمدند و در نتیجه برای آزمایش بعدی در مایع نیتروژن منجمد شدند. برای مطالعه تأثیر IL-23 بر روی سلول های CD4+T ، نمونه های خون پیرامونی از 10 تا 14 بیمار OLP جمع آوری شد. خصوصیات بالینی این شرکت کننده ها در جدول 1 بیان شده است.
رضایت کتبی از هر فرد گرفته شد، و کل روند آزمایش در تطابق با بیانیه هلسینکی انجام شد و توسط هیئت علمی و اخلاقی دانشگاه سیچوان تأیید شد.
جدول 1 – ویژگی های بالینی افراد
2.2 شیمی بافتی و سلولی ایمنی. بخش های ادغام شده با پارافین از نمونه های آسیب OLP و بافت های NOM در زیلین تغییر داده شدند و در اتانول آبدار شدند و سپس فعالیت پروکسیداز برون زاد با 3 درصد پروکسید هیدروژن متوقف شد. پس از بازیابی آنتی ژن توسط گرما و فشار، این بخش ها پادتن تک تاگی IL-17 ضد انسان از بز یا پادتن تک تاگی IL-23p19 ضد انسان از خرگوش در دمای 4 درجه سانتیگراد پرورانده شد. در نتیجه، این بخش ها با پلیمر HRP-پادتن lgG ضد بز از خرگوش ، یا پلیمر HRP-پادتن lgG ضد خرگوش از بز بمدت 15 دقیقه در دمای اتاق و سپس DAB بمدت 1 تا 2 دقیقه پرورانده شد. سپس بخش ها با هموتاکسیلین آغشته شدند. بعنوان کنترل منفی، از سرم غیر ایمن بجای پادتن های اصلی استفاده شد.
ارزیابی مقاومت ایمنی بصورت مستقل توسط دو مشاهده کننده به شیوه ناپیدا انجام می شود. نمایش واحد فرعی IL-23p19 با استفاده از یک سیستم امتیازدهی قراردادی به این صورت ارزیابی شد: 0، بدون آلودگی؛ 1، آلودگی خیلی ضعیف؛ 2، آلودگی ضعیف؛ 3، آلودگی متوسط؛ 4، آلودگی قوی؛ و 5، آلودگی قوی. امتیاز میانگین در هر گروه محاسبه و مقایسه شد. فعالیت های نمایش مانند قبل ارزیابی شدند. برای ارزیابی نمایش IL-17 ، پنج قدرت میدانی بالا در حجم 400× بصورت تصادفی انتخاب شدند و تعداد سلول های +IL-17 بصورت جداگانه شمارش شدند. سپس تعداد میانگین تعداد سلول های +IL-17 در هر میدان محاسبه و مقایسه شد.
2.3 جداسازی و کشت سلول های CD4+Th خون پیرامونی. پنج میلیمتر از خون پیرامونی بترتیب از 10 بیمار OLP بدست آمد. سلول های تک هسته ای خون پیرامونی توسط نیروی گریز از مرکز چگالی-شیب فیکول-هایپک جداسازی شدند. در نتیجه، سلول های کمک کننده CD4+T توسط ذرات مغناطیسی CD4 ضد انسان بر روی یک آهن ربای جداسازی سلول مطابق با دستورالعمل های ساخت، پالایش شدند. سلول های پالایش شده دوباره در همراه با 10 درصد سرم جنین گاوی معلق شدند. برای فعالسازی سلول های ، پادتن CD3 ضد انسان از موش و پادتن CD28 ضد انسانس از موش اضافه شد. برای مطالعه تأثیر IL-23 بر روی سلول های ، سلول ها با IL-23 انسانی بازترکیب و بدون آن بمدت 36 ساعت کشت شدند. در نتیجه، سلول ها و شناورهای کشت بصورت جداگانه برای آلودگی سیتوکین میان سلولی و شناسایی ELISA جمع آوری شدند.
2.4 آلودگی سیتوکین میان سلولی و سیتومتری جریان. برای آلودگی سیتوکین میان سلولی، سلول های جمع آوری شده خون پیرامونی دوباره در چگالی معلق شدند و در محیط بمدت 4 ساعت تحریک شدند که شامل PMA، یونومیسین، و مونسین بود. پس از آن، سلول ها با استفاده از آلوده شدند. سلول های آلوده با استفاده از سیتومتر جریان FACSAria و نرم افزار BD FACSDiva تحلیل شدند.
2.5 ELISA. غلظت IL-17 در شناورهای کشت سلول های خون پیرامونی با استفاده از انسان اندازه گیری شد. مطابق دستورالعمل های ساخت، دامنه قابل شناسایی محتوای IL-17 از 31.2 به رسید.
2.6 کشت و تحریک کراتینوسیت. HOK16E6E7 که یک خط سلول اپیدرمی دهانی دائمی در انسان است، در صفحهات 6 دیواره ای در محیط اپیدرمی بدون سرم قرار داده شد که شامل عامل رشد روپوستی و کلسیم است. پس از رشد 24 ساعته، این محیط با دوزهای مختلف از IL-17 انسانی بازترکیب یا فقط میدیم قرار داده شد. پس از 24 ساعت کشت، سلول ها جمع آوری شدند و تا جداسازی RNA در دمای -70 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
2.7 PCR کمی و فوری. RNA کلی از OLP 14 شبکه ای و 10 نمونه بافت NOM یا سلول های کشت شده با استفاده از واکنشگر TRIzol جدا شد. cDNA از 400 ng از RNA با استفاده از کیت واکنشگر RT پرایم اسکریپ ترکیب شد. پرایمرها از بیوتکنولوژی TAKARA خریداری شدند که در جدول 2 نشان داده شده اند. برای اجتناب از تقویت ژنوم DNA، همه پرایمرها بصورت اکسون-اسکون طراحی شده بودند. PCRکمی و فوری از 10 ng از cDNA با استفاده از شناسایی سبز SYBR بر روی بیوسیستم های اعمال شده از سیستم PCR فوری 7300 انجام شد. روند تقویت بمدت 10 ثانیه در 95 درجه سانتیگراد، و 40 دوره روند تقویت از 95 درجه سانتیگراد بمدت 5 ثانیه و 62 درجه سانتیگراد بمدت 40 ثانیه تشکیل شده بود. هر نمونه بصورت سه تایی انجام می شود. نمایش نسبی ژن بهنجار شده برای نمایش ژن مدیریت GAPDH و نمونه کنترل توسط روش تحلیل شد.
2.8 تحلیل آماری. همه تحلیل های آماری بر روی نرم افزار GraphPad Prism 5 انجام شد. از آزمایش کروسکال-والیس و آزمایش مان-ویتنی برای تعیین تفاوت های بین گروه ها، از آزمایش t جفتی برای مقایسه جفتی، و از آزمایش اسپیرمن برای تحلییل وابستگی ها استفاده شد. مقدار تصور می شد که از لحاظ آماری مهم باشد.
3- نتایج
3.1 - IL-23 و IL-17 در آسیب های OLP بیش از حد نمایش داده میشوند. برای شناسایی اینکه آیا IL-23/IL-17 در بیماری زایی موضعی OLP تأثیر دارد، ابتدا نمایش و توزیع IL-23 p19 و IL-17 را در آسیب های OLP و بافت های NOM را شناسایی کردیم. با استفاده از شناسایی IHC، ما انتشار و نمایش های قوی IL-23p19 را در آسیب های فرسایشگر و شبکه ای مشاهده کرد. آلودگی مثبت IL-23p19 عمدتاً بر بافت پوششی آسیب های OLP و همچنین بر ماتریس میان سلولی آستر مخاط تمرکز داشت. برعکس، فقط سلول های اپیدرمی کمی در لایه روپوستی بافت های NOM آلودگی ضعیف IL-23p19 را نشان دادند. بعلاوه، ما آلودگی مثبت فراوان IL-17 در سیتوپلاسم لنفوسیت های التهابی را در چندین سلول +IL-17 در مخاط دهانی طبیعی پیدا کردیم. داده های آماری نشان دادند که آسیب های OLP فرسایشگر و شبکه ای تا حد زیادی امتیازات آلودگی ایمنی Il-23p19 و همچنین تعداد سلول های + IL-17 را در مقایسه با مخاط دهانی طبیعی افزایش داده بودند. همچنین، آسیب های OLP فرسایشگر در مقایسه با آسیب های OLP شبکه ای شامل تعدادی زیادی از سلول های + IL-17 بودند. البته هیچ تفاوت مهمی بین امتیاز آلودگی IL-23p19فرسایشگر و شبکه ای وجود نداشت.
ما برای تأیید نتایج IHC، نمایش های mRNA از IL-23 و IL-17 را در 14 بافت آسیبی OLP شبکه ای و 10 بافت NOM نیز شناسایی کردیم و پی بردیم که نمایش های mRNA از همه ژن ها در آسیب های OLP در مقایسه با بافت های NOM تا حد زیادی افزایش پیدا کرده بودند.
این داده ها نمایش زیادIL-23 و IL-17 را در آسیب های OLP اثبات کردند، که نشاندهنده اینست که محور IL-23/IL-17 ممکن است در شبکه ایمنی موضعی OLP شامل باشد.
3.2 نمایش های IL-23 و IL-17 رابطه مثبتی با پیشرفت آسیب های OLP دارند. ما با در نظر گرفتن IL-23 بعنوان یک عامل محرک سیتوکین IL-17 ، این مسئله را بررسی کردیم که آیا تنظیم IL-23 در پیشرفت آسیب OLP با نمایش افزایشی IL-17 همراه است یا نه. ما با تحلیل بر اساس داده های بالا، هیچ رابطه ای را بین امتیازات آلودگی IL-23p19 و تعداد سلول های + IL-17 در آسیب های OLP پیدا نکردیم. البته در گروه فرعی OLP شبکه ای، رابطه مثبتی بین امتیازات الودگی IL-23p19 و تعداد سلول های + IL-17 وجود داشت، درحالیکه هیچ رابطه ای در گروه OLP فرسایشی یافت نشد.
جدول 2 – طراحی پرایمر برای PCR کمی و فوری
بعلاوه، ما پی برده ایم که نمایش های mRNA از واحدهای فرعی IL-23 و IL-23p19 رابطه مثبتی با نمایش mRNAاز IL-17 در نمونه های OLP شبکه ای دارد. نتایج نشان دادند که نمایش زیاد آسیب OLP شبکه ای، نقش تنظیمی بالقوه ای را برای IL-23 نسبت به نمایش IL-17 در مرحله اولیه آسیب OLP نشان میدهد.
3.3 –IL-23 درصد تولید سلول های Th17 و IL-17 را در سلول های از بیماران OLP افزایش میدهند. ما سپس نقش بالقوه IL-23 را در تولید IL-17 در OLP بررسی کردیم. اگرچه بتازگی گزارش شده است که IL-17 توسط انواع مختلفی از سلول ها تولید می گردد، یک زیرمجموعه سلول با نام سلول Th17 یکی از منابع اصلی آن است. از طرف دیگر، در آسیب موضعی OLP ، تراوش التهابی مخاطی متراکم عمدتاً از سلول های تشکیل می گردد. بنابراین ما در اینجا بر تأثیر IL-23 برای تولید IL-17 در سلول های از 10 بیمار OLP تمرکز میکنیم. ما مشاهده کردیم که تحریک rIL-IL-23 در مقایسه با گروه کنترل، تا حد زیادی درصد سلول های CD4+IL-17+ در سلول های از بیماران OLP را افزایش میدهد. همچنین، محتوای IL-17 در شناور کشت سلول های نیز تحت تحریک IL-23 از گروه کنترل افزایش یافته است. این داده ها نشان میدهند که نمایش زیادIL-23 در آسیب های OLP احتمالاً به تحریک Th17 و تولید IL-17 کمک میکند.
3.4 –IL-17 بصورت انتخابی نمایش های واسط های التهابی را در کراتینوسیت های دهانی تنظیم میکند. ما سپس اثرات زیستی بالقوه IL-17 ، و ضرورت انگیز رسان محور IL-23/IL-17 را در آسیب های OLP بررسی میکنیم. کاملاً مشخص است که کراتینوسیت دهانی یک مؤلفه مهم در ایمنی مخاط دهانی است و نقش مهمی را در بیماری زایی بسیاری از بیماری های دهانی التهابی مزمن (از جمله OLP) با تولید واسط های التهابی مختلف (مانند سیتوکین، چموکین، و دفنسین) ایفا میکند. بنابراین، ما تأثیر IL-17 بر روی نمایش های واسط های التهابی را توسط HOK16E6E7 بررسی کردیم که یک خط سلولی کراتینوسیت دهانی انسانی است.
فرمت این مقاله به صورت Word و با قابلیت ویرایش میباشد
تعداد صفحات این مقاله 18 صفحه
پس از پرداخت ، میتوانید مقاله را به صورت انلاین دانلود کنید
دانلود با لینک مستقیم
دانلود مقاله نمایش زیاد و نقش های تنظیمی انتخابی محور 
